Метод шахматной доски в микробиологии

Обновлено: 28.04.2024

Число клеток микроорганизмов в единице объема или массы продукта можно определить либо непосредственным их подсчетом под микроскопом, либо путем подсчета колоний, выросших на питательных средах при посеве разведений продукта, или другими методами.

Кроме того, в микробиологической практике часто определяют биомассу - массу сухого вещества клеток, выраженную в граммах, выросшую в определенном объеме питательной среды. Непосредственный подсчет клеток проводят в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках и на мембранных фильтрах. При непосредственном подсчете микроорганизмов под микроскопом учитывают, как живые, так и мертвые клетки, что дает завышенные результаты о числе жизнеспособных клеток в субстрате.

10.1. Подсчет клеток микроорганизмов в камере Горяева

Цель работы: произвести подсчет клеток суспензии дрожжей в камере Горяева.

В камерах Горяева, Тома-Цейса и других можно произвести подсчет только крупных клеток микроорганизмов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых крупных бактерий.

Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. На каждой половинке выгравирована сетка. Площадь квадрата сетки и глубина камеры указаны на предметном стекле и равны соответственно 1/25 (большой квадрат) и 1/400 мм 2 (малый квадрат). Глубина камеры равна 0,1 или 0,2 мм.

Суспензию дрожжей перед подсчетом клеток разбавляют водой в зависимости от предполагаемой их концентрации. На поверхность сетки камеры Горяева наносят небольшую каплю исследуемой суспензии микроорганизмов, накрывают специальным шлифованным покровным стеклом и притирают его к боковым площадкам до появления так называемых Ньютоновых колец. Подсчет клеток рекомендуется начинать не раньше, чем через 3-5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и расположились в одной плоскости. Клетки подсчитывают с объективом 8х или 40х. Для получения достоверных результатов подсчет следует проводить в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали, при этом количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10. В противном случае суспензию следует развести водопроводной водой.

Количество клеток в 1 см суспензии вычисляют по формуле

С = а • 1000 • n/hS,

где С - число клеток в 1 см 3 суспензии; а - среднее число клеток в квадрате сетки; 1000 мм2 = 1 см 3 ; n - разведение исходной суспензии; h - глубина камеры в мм; S - площадь квадрата сетки в мм 2 .

10.2. Непосредственный подсчет клеток под микроскопом (метод Виноградского-Брида)

Цель работы: произвести подсчет клеток лактобацилл в кисломолочном продукте.

Преимущество этого метода, по сравнению с учетом клеток в счетной камере, заключается в возможности подсчитывать клетки микроорганизмов малых размеров, так как подсчет проводят с использованием иммерсионного объектива.

Препарат готовят следующим образом. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечают квадрат площадью 4 см 2 , и обводят его стеклографом или тушью. Готовят суспензию микроорганизмов, для чего 1 см 3 кисломолочного продукта вносят в пробирку с 9 см физиологического раствора (n = 10). Затем на предметное стекло наносят микропипеткой строго определенный объем исследуемой суспензии микроорганизмов (обычно 0,01 или 0,02 см 3 ). Тщательно распределяют суспензию бактериологической петлей по всей площади квадрата, отмеченного на стекле. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают в течение 2 мин метиленовым синим, промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. На препарат наносят каплю кедрового масла и рассматривают с иммерсионным объективом. Чтобы результат был достоверным, подсчет числа клеток рекомендуется проводить не менее чем в 20 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток должно быть не менее 600. В мазке микроорганизмы распределяются неравномерно: в центре их содержится больше, чем по краям. Поэтому для получения среднего значения следует вести подсчет по диаметру мазка, смещая поле зрения от одного конца диаметра к другому.

Количество клеток в 1 см суспензии вычисляют по формуле

где С - число клеток в 1 см 3 суспензии; а - среднее число клеток в одном поле зрения; S - площадь приготовленного мазка (400 мм 2 ); n - разведение исходной суспензии; s - площадь поля зрения (0,02 мм 2 ; V - объем нанесенной на предметное стекло суспензии микроорганизмов (0,01 или 0,02 см 3 ).

10.3. Прямой подсчет количества микроорганизмов флуоресцентным методом

Флуоресцентная микроскопия основана на способности некоторых биологических объектов люминесцировать, т. е. светиться при освещении ультрафиолетовым или синим светом вследствие того, что свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). При этом объекты будут светиться желто-зеленым или оранжевым светом. Это собственная или первичная люминесцения. Поскольку большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это окрашивание их специальными красителями флуорохромами - сильно разбавленными растворами флуоресцирующих красителей. Из синтетических флуорохромов наилучшие результаты дают акридин желтый или оранжевый, корифосфин, примулин, родамин. Такой вид люминесцении в отличие от первичной носит название наведенной (вторичной).

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет:

✵ сочетать цветное изображение и контрастность объектов;

✵ исследовать как прозрачные, так и непрозрачные живые объекты;

✵ изучать морфологию как живых, так и мертвых клеток микроорганизмов;

✵ исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, и определять функциональноморфологические изменения клеток;

✵ исследовать различные жизненные процессы в динамике их развития.

Микробные клетки окрашивают акридиновым оранжевым и концентрируют их на фильтрах методом центрифугирования или фильтрования. В проходящем свете с длиной волны 450 нм живые бактерии светятся зеленым светом, а мертвые - оранжево-красным. Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим признакам, что дает возможность охарактеризовать как состав сообщества, так и общую численность микроорганизмов (кл/см 3 ) в исследуемом объекте.

Люминесцентная микроскопия широко используется в медицинской микробиологии для диагностики возбудителей туберкулеза, дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др.

Разработан ГОСТ Р 52415-2005 Молоко натуральное коровье - сырое. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов.

В настоящее время для исследований применяют следующие модели люминесцентных микроскопов, выпускаемых отечественной промышленностью: ЛЮМАМ 3-8, МЛД-2, ЕС БИМАМ Р—11, ЕС БИМАМ Р—13.

К главным недостаткам люминесцентной микроскопии относятся низкое разрешение при подсчете мелких бактериальных клеток (размером менее 1 мкм) и, следовательно, пропуск их большей части, большое напряжение зрения при подсчете мелких клеток, а также затемненные условия микроскопирования.

10.4. Метод проточной цитометрии

Проточная цитометрия (ПЦ) является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов. Принцип метода ПЦ основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки. Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцентными красителями, под давлением подается в проточную ячейку, где за счет гидродинамического фокусирования клетки, находясь в ламинарном потоке, выстраиваются в цепочку друг за другом. В момент пересечения клеткой лазерного луча высокочувствительные детекторы регистрируют интенсивность ее флюоресценции и рассеянное лазерное излучение. В ходе анализа учитывается также уровень флюоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлюоресценция). Полученный сигнал подается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков или гистограмм. Аппарат для проведения ПЦ позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, активность ферментов, содержание белков, ДНК, липидов, антигенных веществ.

Метод ПЦ находит самое различное применение, начиная от простого подсчета клеток и определения их жизнеспособности и заканчивая более сложными исследованиями в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии.

10.5. Определение количества микроорганизмов методом мембранного фильтрования

Сущность метода состоит в том, что определенный объем исследуемой пробы (питьевой воды, стойких безалкогольных напитков, пастеризованного пива) фильтруют через мембранные фильтры с размером пор от 0,15 до 0,25 мкм (см. раздел 10.3). Осевшие на фильтре микроорганизмы окрашивают и подсчитывают под микроскопом с применением окулярного сетчатого микрометра в нескольких полях зрения на определенной площади препарата. Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим группам, что дает возможность охарактеризовать как состав микробного сообщества, так и (после суммирования данных) общую численность микроорганизмов в исследуемом объекте.

10.6. Определение количества микроорганизмов методом подсчета колоний (чашечный метод)

Цель работы: определить количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в пищевом продукте.

Чашечный метод широко применяется для определения численности жизнеспособных клеток микроорганизмов в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В основе метода лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Однако необходимо учитывать, что для микроорганизмов, образующих цепочки или другие скопления клеток, результаты всегда несколько занижены. Поэтому при использовании чашечного метода результат выражают не числом клеток в единице массы или объема, а количеством колониеобразующих единиц (КОЕ). В отличие от прямого подсчета клеток под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток.

Определение чашечным методом числа микроорганизмов включает следующие этапы: отбор проб и подготовку их к анализу, приготовление разведений микробной суспензии, посев в чашки Петри на плотную среду, инкубацию посевов при оптимальной температуре, подсчет выросших колоний и обработку результатов.

В качестве питательной среды для учета бактерий используют мясопептонный агар, на котором могут расти только сапрофитные аэробные и факультативно анаэробные бактерии, но неспособны расти строго анаэробные. Дрожжи и мицелиальные грибы обычно выращивают на сусло-агаре.

10.7. Учет живых микроорганизмов методом предельных разведений

Метод предельных разведений применяется для установления количества микроорганизмов отдельных физиологических групп (молочнокислых, уксуснокислых бактерий, кишечных палочек и др.). Сущность метода состоит в том, что делается ряд десятикратных разведений исследуемого материала. Количество разведений готовится в зависимости от предполагаемого содержания бактерий в исследуемом объекте таким образом, чтобы в последних разведениях данных бактерий не было. Материалом, взятым из приготовленных разведений, засевают определенное число пробирок с питательной средой. После инкубации при оптимальной температуре визуально устанавливают, в каком наименьшем количестве исследуемого материала еще находятся представители данной группы микроорганизмов.

Если для определения числа живых микроорганизмов используют бульонную питательную среду, то после инкубации пробирки, в которых размножились микроорганизмы, окажутся мутными, а пробирки, засеянные разведениями, в которых уже не содержалось жизнеспособных микроорганизмов, останутся прозрачными. Доля пробирок, оказавшихся мутными при посеве культуры данного разведения, зависит от числа живых клеток в неразведенной культуре. По числу мутных пробирок в группах, засеянных суспензиями трех последовательных разведений, определяют с помощью соответствующих таблиц наиболее вероятное число (НВЧ) клеток микроорганизмов.

10.8. Нефелометрический метод определения биомассы

Нефелометрический (турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии микроорганизмов.

Нефелометрический метод основан на рассеивании пучка света взвешенными в жидкой фазе частицами. Данный метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и при этом не происходит образования мицелия, пленок и других скоплений. Питательная среда, в которой культивируют микроорганизмы, должна быть оптически прозрачной.

Светорассеяние, вызываемое микроорганизмами, выросшими в питательном бульоне, наиболее удобно измерять с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра (СФ) при длине волны от 540 до 650 нм, при которой поглощение света данной суспензией является минимальным.

Зависимость между интенсивностью падающего света (l0) и прошедшего света I (т.е. света, не рассеянного культурой) при малых концентрациях бактерий подчиняется закону Ламберта-Бера:

где ε - коэффициент экстинкции, l - толщина слоя суспензии, с -концентрация бактерий. Из этого соотношения следует:

График зависимости lg (lо/l) от с (концентрации бактерий) имеет вид прямой, угол наклона которой определяется произведением εl. Таким образом, изменение оптической плотности, вызываемое изменением концентрации бактерий на одну единицу, зависит от толщины слоя суспензии l и свойств суспензии, характеризуемых коэффициентом ε.

При высоких концентрациях бактерий закон Ламберта-Бера теряет свою силу.

Для определения числа бактерий нефелометрическим методом строят калибровочные кривые зависимости между величиной светорассеяния и числом клеток (или сухой биомассы в единице объема среды). Для построения калибровочной кривой измеряют на ФЭК или СФ величину светорассеяния суспензии с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют количество клеток и биомассы. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс - количество клеток, содержащееся в 1 см 3 суспензии, или биомассу в 1 дм 3 культуральной среды. Для каждого микроорганизма необходимо строить свою калибровочную кривую.

Контрольные вопросы

1. Какие методы определения количества микроорганизмов в различных объектах вам известны?

2. С какой целью готовят серию разведений исследуемого объекта для определения общего количества микроорганизмов при использовании чашечного метода? Что такое КОЕ?

3. Все ли бактерии, находящиеся в исследуемом продукте, учитываются чашечным методом?

4. Какие питательные среды используют для определения в продукте количества бактерий и грибов (дрожжей и плесеней)?

5. Каковы достоинства и недостатки флуоресцентного метода подсчета микроорганизмов?

6. В чем заключается сущность метода проточной цитометрии?

7. На чем основан нефелометрический метод определения количества бактерий или биомассы в суспензии?

Биологическая библиотека - материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.

Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.

Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.

Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.

— Шахматы! — говорил Остап. — Знаете ли вы, что такое шахматы? Они двигают вперед не только культуру, но и экономику!

Шахматы, как известно, изобрели в Индии, и многие, вероятно, слышали легенду о том, какую награду попросил изобретатель у индийского царя. Сначала его просьба показалась властителю более чем скромной. И действительно, в награду за изобретение столь увлекательной игры он попросил не золото, не драгоценные камни, а всего лишь пшеничные зерна. Но когда подсчитали их количество, которое нужно было отдать изобретателю (а он попросил, чтобы на первую клетку шахматной доски положили два зернышка, а на каждую следующую — в два раза больше, чем лежит на предыдущей, и т. д.), получилась фантастическая цифра — 2 64 , или 18 446 744 073 709 551 616 зерен, что составляет примерно 600 млрд тонн. О том, как завершился разговор изобретателя с царем, легенда умалчивает. Можно только гадать, казнил ли он незадачливого изобретателя, узнав о поистине астрономической величине награды, либо только прогнал его, оставив без вознаграждения: владыки не любят расписываться в собственной несостоятельности. И в самом деле, было отчего разгневаться: 600 млрд тонн. Ведь даже в наше время, если бы благодарное человечество решило удовлетворить просьбу изобретателя шахмат, то оно должно было бы отдать ему более 300 годовых урожаев нашей планеты.

Но при чем тут микробы? А вот причем. Способность микроорганизмов к размножению феноменальна. Каждые 20 минут их количество удваивается, т. е. за 20 часов оно увеличивается в 2 60 раза. Получается то же фантастическое число, что и количество зерен, которое запросил изобретатель шахмат. Так что, будь индийский царь немного знаком с основами микробиологии, он бы мог вполне корректно отблагодарить изобретателя шахмат, не бросив и тени на свою репутацию владыки. Нужно было лишь дать ему несколько микробов и пропись среды, на которой они могут развиваться, и эти микроорганизмы обеспечили бы изобретателя затребованной наградой в довольно короткий срок. Правда, пришлось бы создать условия для беспрепятственного роста микроорганизмов, но не царское дело — вникать в такие детали: это задача для микробиолога.

Учитывая огромную скорость размножения микробов и их относительную неприхотливость к питательным веществам, остается только удивляться, как до сих пор они не вытеснили всех других представителей флоры и фауны. Что же все-таки сдерживает их развитие? Прежде всего, нельзя забывать, что количество питательных веществ ограниченно. Кроме того, рост микроорганизмов тормозится продуктами обмена веществ, вызывающими самоотравление. В природной среде трудно обойти эти факторы. Но в условиях эксперимента можно обеспечить постоянный приток свежих питательных веществ и отток продуктов метаболизма, и тогда микроорганизмы смогут размножаться достаточно долго, оставаясь на стадии экспоненциального роста. Кстати, о стадиях развития микроорганизмов.

Помните загадку Сфинкса, которую тот задал Эдипу: «Скажи мне, кто ходит утром на четырех ногах, днем — на двух, а вечером — на трех?»

Ответ на эту загадку Сфинкса олицетворяет не только развитие человека, но и всего живого. В равной степени она относится и к развитию микроорганизмов. Однако в отличие от человека они в своем развитии проходят несколько большее число фаз. Так, различают лаг-фазу — период приспособления к среде; экспоненциальную фазу с высокой степенью увеличения числа клеток, когда их количество возрастает в геометрической прогрессии; фазу замедленного роста, во время которой скорость роста микроорганизмов уменьшается и их количество уже не возрастает, а остается на одном уровне; и, наконец, пятая стадия — фаза отмирания, когда количество клеток уменьшается.

Все эти фазы плавно переходят одна в другую, и четко установить границу между ними бывает достаточно трудно. Можно только утверждать, что в той или иной фазе развития находится достаточно большой процент клеточной популяции.

Каждая из фаз имеет определенную продолжительность, не одинаковую у различных культур, при этом любая из них, находясь в конкретной фазе развития, обладает неповторимыми особенностями, тщательное изучение которых представляет огромный интерес для микробиологов. Конечно, наибольшее внимание привлекает фаза, в которой происходит интенсивное увеличение числа клеток.

Однако как поддержать клеточную популяцию в этом нужном состоянии постоянной молодости? И здесь на помощь микробиологам приходит уже упомянутый метод непрерывного культивирования. На чем он основан, или в чем секрет вечной молодости микроорганизмов?

Метод заключается в том, что в ростовую среду постоянно вводятся свежие питательные вещества и выводится соответствующее количество микробных клеток и продуктов метаболизма. При хорошей согласованности этих двух потоков система находится в состоянии динамического равновесия, и непрерывное выращивание микроорганизмов может продолжаться достаточно долго, хотя не бесконечно, так как в конце концов начинают действовать и другие факторы, например вырождение культуры и т. п.

И тем не менее благодаря этому методу можно получать микробный белок, близкий по составу к белку пшеницы. Этот путь ведет не только к удовлетворению запросов легендарного изобретателя шахмат, но и к решению продовольственной проблемы для человечества в целом.

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспери­ментальный, иммунологический.

1.Микроскопический - изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический - (бактериологический, культурный) - посев материала на питатель­ные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура - скопление микробов одною вида, выращенных на питательной среде. Штамм - чистая культура, выделенная из кон­кретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон - генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в гене­тических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) - заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

- выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

- изучить болезнетворные свойства микроба;

- получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) - изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы - антитела (AT), способные вступать с данным ан­тигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан па выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей ин­фекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентифи­кация по антигенной структуре).

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду (МПА), поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

2) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

3) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

4) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рисунок 4.2, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рисунок 4.2, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рисунок 4.2), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рисунок 4.2). Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

Рисунок 4.2 – Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний

Последовательные разведения в твердой среде– самый простой способ посева по чашкам, который заключается в том, что после инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром, среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15–20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара.

Для изучения формы и выявления подвижности бактерий их исследуют в живом состоянии в препаратах раздавленной или висячей капли.

Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раство­ром хлорида натрия (рец. 31). Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и опускают, постепенно вытесняя воз­дух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования в капле пузырьков воздуха. В пра­вильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.

Препарат микроскопируют, используя объективы х40 или х50. Очень хорошие результаты дает микроскопия этих пре­паратов в темном поле.

Недостаток метода в том, что препараты быстро высыха­ют, поэтому следует просматривать их сразу после изготовле­ния или помещать во влажную камеру (чашка Петри, на дно которой положено 2–3 кружка влажной фильтровальной бу­маги, покрытых двумя сухими фильтровальными листками).

Висячая капля. На середину обезжиренного покровного стекла наносят небольшую каплю культуры в бульоне или физиологическом растворе, покрывают предметным стеклом с лункой таким образом, чтобы капля свободно висела в центре лунки, не касаясь ее дна. Для того чтобы создать герметизи­рованную камеру, края лунки предварительно смазывают вазе­лином. После этого предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом переворачивают. Капля оказывается вися­чей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат дол­гое время остается пригодным для изучения (рис. 6.1).

Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (х8) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зрения. По одну сторону края видно множество мельчайших капелек кон­денсата, осевших на внутренней поверхности покровного стек­ла, по другую сторону края фон равномерно серого цвета – искомая капля. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на объектив (х40) или иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.

Подвижные бактерии проходят с одинаковой скоростью большие пространства, иногда через все поле зрения микро­скопа, вращаясь вокруг своей оси.

Живые микробы, находящиеся в висячей капле, можно изу­чать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопирования толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных – 0,2 мм.

При микроскопировании препаратов в темном поле зрения на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кедрового или вазелинового масла, поверх которой очень осторожно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, накладывают пре­парат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопировании с иммерсионной систе­мой проходящие лучи света не преломлялись.

Читайте также: