Контаминация материала при заборе

Обновлено: 28.04.2024

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРОВЕДЕНИЮ РАБОТ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

1. Область применения

Данный документ предназначен для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора, использующих метод полимеразной цепной реакции в целях диагностики инфекционных заболеваний.

2. Обоснование необходимости

Благодаря высокой специфичности и чувствительности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Однако ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации.

Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с двумя видами контаминации:

1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;

2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств.

Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих полимеразную цепную реакцию для диагностики инфекций (ПЦР-диагностические лаборатории) позволяет сформулировать основные требования к планировке таких подразделений и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований обеспечивает исключение возможности контаминации и получения ложно-положительных результатов.

3. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностических лабораторий

1). Лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:

- пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации; в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами.

5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

7). Обработка рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должна производиться раздельно.

8). Следует однократно использовать перчатки, как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.

9). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

10). Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

11). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

12). В пре-ПЦР и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники.

13). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.

14). Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

15). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работа должна проводиться с соблюдением “Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности)” и “Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения”, М., 1980.

16). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

- каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 70о этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.

- при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя) и затем 70о этанолом.

- следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы 70о этанолом с целью борьбы с пылью.

17). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.

18). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

4. Требования к проведению ПЦР-анализа

4.1. Обработка клинических образцов.

1). Забор клинических образцов необходимо производить только в одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные.

2). Работать только в одноразовых перчатках.

3) необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

4). Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой.

5). Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с 1Н раствором соляной кислоты.

4.2. Постановка ПЦР.

1). Работать только в одноразовых перчатках.

2). Следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все пробы, включая контрольные, и затем - раскапывать ее по пробиркам.

3). Использовать автоматические пипетки с переменным объемом и одноразовые наконечники.

4). В каждый момент работать только с одной пробиркой.

5). Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов.

6). Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавляться в реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером в последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкость с 1Н. раствором HCl.

4.3. Детекция продуктов амплификации.

1). Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью.

2). Работать следует только в одноразовых перчатках.

3). Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также уборочный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), должны храниться только в этой комнате и не должны попадать в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате детекции продуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви.

5. Использование физических и химических методов борьбы с контаминацией

1). Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

2). Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 Н HCl, 10% гипохлоритом натрия или 10% хлорной известью).

6. Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории

1). Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфекции.

2). Следует периодически проводить оценку чувствительности диагностических наборов на основе полимеразной цепной реакции.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Москва, 1995 г.

Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора; исполнители: Покровский В.В.,Федоров Н.А.,Шипулин Г.А.,Безруков В.М.

Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Госкомсанэпиднадзора; исполнители: Бектимиров Т.А.,Блоха В.В.

Российским научно-исследовательским противочумным институтом Госкомсанэпиднадзора; исполнитель: Куличенко А.Н.

2. УТВЕРЖДЕНО “22” июня 1995г.

Рассмотрены и рекомендованы к утверждению Ученым советом ГИСК им. Л.А.Тарасевича (протокол № 5 от 28 марта 1995 года)

Сотрудников, проводящих деконтаминацию, обеспечивают одноразовыми халатами, тапочками, перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления моющих и дезинфицирующих растворов.

Каждую зону лаборатории обрабатывают работающие в ней сотрудники.

Утилизируют все находящиеся в «контаминированной» зоне реактивы.

Утилизируют исследуемые материалы на всех промежуточных стадиях обработки.

Проводят обработку паром под давлением всей спецодежды «контаминированной» зоны.

Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря.

Обработку проводят от участка к участку последовательно, каждый участок обрабатывают отдельной ветошью.

Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляют ветошью, смоченной водой.

На поверхность наносят на 30 минут дезинфицирующий раствор 0,2% ДП-2Т или аналогичный ему, разрешенный к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

После завершения указанной обработки проводят обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение одного часа.

Дезинфекцию дезрастворами с обработкой помещения ультрафиолетом повторяют еще раз.

Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.

По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностику которых осуществляют в данной лаборатории.

Для проведения смывов стерильный зонд смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере, после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек и косяков, телефонов и т.п.

В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦР-анализа обработку повторяют.

Загрязненный расходный материал утилизируют.

Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.

Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.

Постаналитический этап

Все результаты, выходящие за пределы референсных значений, просматриваются врачом-лаборантом или врачом-аналитиком. Результаты, вызывающие подозрение или не укладывающиеся в какую-либо клиническую картину, просматриваются, и в случае необходимости принимаются решения о перестановке анализа или выдаче результата с сопроводительной записью. С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа (табл. 6).

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики

Возможность лабораторного контроля

Контаминация пробы на стадии забора материала

Использование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных “положительной” ДНК

Использование разового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медицинского персонала

Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР

Проба содержит примеси ингибиторов ПЦР. Сильными

Осуществляется при использовании тест-систем с внутренним контролем

Использование разового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материала

Забор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры.

Несоблюдение правил забора материала (вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь)

В некоторых случаях

возможен при визуальном контроле

Соблюдение правил забора материала; использование специальных одноразовых щеточек-зондов

Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы

Несоблюдение правил транспортировки и хранения проб

Соблюдение правил транспортировки и хранения проб

Потери ДНК во время пробоподготовки

Несоблюдение инструкции выделения ДНК; использование некачественных реактивов

Возможен при проведении положительного образца через все стадии пробоподготовки

Соблюдение инструкции выделения ДНК; использование качественных реактивов

Контаминация в отдельных пробах

Нарушение правил работы в ПЦР - лаборатории; использование одного наконечника при обработке разных проб; при внесении реагентов наконечник касается стенок пробирки; загрязнение дозатора

Возможен при постановке параллельных проб

Соблюдение правил работы в ПЦР - лаборатории; инструкции выделения ДНК и постановки ПЦР; использование наконечников с фильтрами

Загрязнение реагентов, дозаторов “положительной” ДНК

Осуществляется при постановке отрицательного контроля

Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, т.к. именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Как показывает практика, при соблюдении правил работы и выполнении требований инструкций во время постановки ПЦР вероятность ошибок невысока.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований, например, с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа. Рассмотрим случай, когда ПЦР-анализ на хламидии дает отрицательный результат, а ИФА выявляет противохламидийные антитела. Причиной подобного расхождения могут быть:

“иммунологический след” – остаточный уровень IgG после ранее перенесенной хламидийной инфекции. У некоторых людей повышенный уровень антител может сохраняться многие месяцы и годы после полного выздоровления, что связано с индивидуальными особенностями иммунной системы;

при проведении ИФА использовалась родоспецифическая тест-система, выявляющая все виды хламидий, в том числе респираторные: Ch. pneumonia, Ch. pecorum, Ch. psitaci, а при проведении ПЦР - анализа – видоспецифическая на Ch. trachomatis. В случае хламидийной инфекции, вызванной Ch. pneumonia, результат ИФА будет положительным, а результат ПЦР-анализа – отрицательным;

материал для ПЦР-анализа получен не из места локализации инфекционного агента. Например, при хроническом сальпингите хламидии могут быть не обнаружены в области шейки матки, а наличие инфекционного процесса будет сопровождаться выработкой антител. При туберкулёзе половых органов поражается эндометрий матки. Поэтому "привычное" для гинеколога взятие влагалищного мазка может привести к ложноотрицательному результату. При туберкулёзе данной локализации следует исследовать материал, полученный из полости матки, либо менструальную кровь.

Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. Это возможно при хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией. Так, при хроническом хламидиозе до 5% больных имеют титр противохламидийных антител, не превышающий критического уровня. При первичной инфекции следует также учитывать серонегативный период, когда, несмотря на клинические проявления заболевания, антител еще нет. Для урогенитальных инфекций этот период может составлять до двух недель.

Мировые руководства и стандарты не рекомендуют постановку диагноза «хламидиоз» по наличию антител IgA, IgM, IgG. Также не рекомендовано использовать определение антител для установления излеченности хламидиоза. Для диагностики хламидиоза, трихомониаза, микоплазмоза многолетним клиническим опытом разработаны и опробованы «классические» лабораторные методы – микробиологические (исследование мазка и посев на питательные среды), иммунологические (индикация методом ПИФ). Но под воздействием лечения морфологические и антигенные свойства возбудителей урогенитальных инфекций изменяются, и в этих случаях ПЦР-метод остается практически единственным, способным оценить результаты проведенной терапии урогенитальных инфекций.

Взаимодействие лабораторной службы и врачебного персонала является необходимым условием эффективной диагностики. Назначение тех или иных диагностических исследований целиком и полностью зависит от лечащих врачей. Стремительное развитие диагностической медицины приводит к тому, что клиницисты не могут в полной мере оценить возможности современных технологий. Часто недостаточная осведомленность или невозможность назначить нужное исследование, неправильный забор пробы приводят к тому, что уже на первом этапе допускаются ошибки, снижающие результативность использования дорогих и высокоинформативных технологий. В первую очередь необходимо отметить комплексность современной лабораторной диагностики. Сегодня вряд ли можно говорить о том, что какой-то из методов, применяемый изолированно, способен дать объективные и достоверные результаты. На начальном этапе принятия решения о подборе необходимого комплекса диагностических мер требуется ставить вопрос о разумном сочетании различных – как новейших, так и хорошо зарекомендовавших себя традиционных методов исследования с целью верификации присутствия инфекционного агента у пациента. Исключительную важность имеет также доказательность участия инфекционного агента именно в том патологическом процессе, который наблюдают клиницисты. Проблема заключается в том, что многие инфекционные агенты, с которыми приходится сталкиваться в ежедневной практике, относятся к так называемой латентной, или оппортунистической, группе. Выявление таких агентов не всегда является свидетельством их участия в патологическом процессе. Иногда инфекционный агент может быть обнаружен, однако его участие в воспалительном процессе оказывается минимальным либо вообще отсутствует, поскольку в данном случае он является сапрофитной флорой. Это касается многих как вирусных, так и бактериальных инфекций. Для того чтобы назначать этиологическое, а не синдромальное лечение, необходимо проводить мультифакторное исследование, стремясь точно определить роль того или иного патогена в конкретной клинической картине.

Использование ПЦР уже на поликлиническом этапе позволяет оперативно выявить больных пациентов и сразу после получения положительного результата анализа, в течение одних–двух суток с момента обращения, назначить антибактериальную терапию.

Химическая контаминация — непреднамеренное воздействие опасных для здоровья лекарственных средств на медицинского работника.

Организация NIOSH (American National Institute for Occupational Safety and Health) разработала следующие критерии, по которым лекарство при применении малых доз считается опасным для здоровья: карциногенность, тератогенность или воздействие, связанное с развитием токсического эффекта на органы и системы человека и животных 1 .

Знаете ли вы, что.

Причины

В наши дни все механизмы проникновения токсических веществ в организм человека еще не изучены 2 . В современной литературе упоминается два пути проникновения токсических веществ в организм человека: через контакт с кожей 3 и вдыхание аэрозоля 2 .

Контаминация при контакте с кожей

Источники химического загрязнения при контакте с кожей:

контакт с поверхностью инфузионных флаконов 4 ;
контакт с поверхностью лекарственных упаковок 5 ;
приготовление цитостатиков, например циклофосфамид 6 ;
пролитые растворы;
заполненная инфузионная система;
использование лекарственных средств вне аптеки 1 ;
биологические жидкости пациентов, которым проводится химиотерапия 2, 6 .

Химическое загрязнение в перечисленных случаях говорит о том, что его причины — это приготовление цитостатиков, обращение с флаконами, коробками и жидкостями организма. Другими причинами контаминации, упомянутыми в регламентирующем документе NIOSH, могут оказаться, например, плохо обеззараженные растворы, заполненная инфузионная система, ошибки в выборе лекарственного средства или неправильный выбор медицинских изделий 1 .

Контаминация при вдыхании аэрозоля

Аэрозоль может оказывать токсическое воздействие во время приготовления и введения лекарственных средств. В ряде исследований были измерены концентрации противоопухолевых препаратов в воздухе в медицинских учреждениях.

В большинстве случаев процент концентрации аэрозолей опасных лекарственных средств в воздухе был низкий 1 . Недавно опубликованные экспериментальные исследования подтвердили эти результаты 7, 8 .

Тем не менее, в исследовании Huang et al. показано, что на внутренней и внешней стороне хирургических масок присутствуют значительные концентрации фторурацила 7 . В исследовании Sessink et al. также отмечено, что фторурацил можно обнаружить на маске после того, как специалист приготовил большое количество флаконов с фторурацилом 9 .

Последствия

Степень повреждающего воздействия при химической контаминации зависит от типа лекарственного средства. Поэтому необходимо отличать токсичные лекарственные средства от нетоксичных.

Нетоксичные лекарственные средства

Воздействие нетоксичных лекарственных средств, таких, как антибиотики, не безобидно. Часто оно становится причиной воспалительных заболеваний кожи 10 и реакции повышенной чувствительности 11 , что в результате снижает эффективность работы медицинского персонала.

Токсическое воздействие лекарств

Острые симптомы
В инструкции по применению лекарственного средства должно быть указание на его токсическое воздействие и связанные с применением побочные эффекты.
Инструкция к таким лекарствам, как, например, Паклитаксел, содержит информацию о том, что препарат может вызывать симптомы острой интоксикации: тошноту, алопецию (облысение) и брадикардию 12 . Исследования демонстрируют возрастание схожих симптомов (диарея, першение в горле, покраснение кожи) между группой контроля и группой, применяющий противоопухолевые препараты 13 . Однако, главным острым симптомом является мутагенность. Различные исследования демонстрируют различные мутации, например, изменения или аберрации сестринской хроматиды 13 . Возникновение хромосомных мутаций имеет случайный характер 14 , ее может вызвать всего лишь одна молекула вещества. Поэтому официальных сведений о минимальном количестве повреждающего вещества, которое может вызвать мутации, нет.
Хронические симптомы: карциногенность
Мутации, возникающие как ответ на повреждающее воздействие химических веществ, могут привести к развитию онкологических заболеваний. Взаимосвязь между воздействием больших доз цитостатиков и вторичной злокачественной неоплазией продемонстирована в исследованиях, которые проводились Международным агентством по исследованию раковых заболеваний (IARC). В результате этих исследований противоопухолевые препараты были отнесены к первой группе риска возникновения мутаций 10 . Случайная природа возникновения канцерогенного эффекта делает опасным воздействие даже низких доз противоопухолевых средств. Исследования, демонстрирующие такую связь, связаны с определенными трудностями из-за ограниченного объема выборки. В результате обработки данных исследования Sessink было выявлено, что теоретически риск возникновения лейкемии в течение всей жизни сохраняется у 95–475 миллионов работников системы здравоохранения 15 . Исследования Skov также подтверждают возрастание риска лейкемии и неходжкинской лимфомы у медицинских работников 16 .
Воздействие на репродуктивную систему
Некоторые работы демонстрируют возрастание случаев невынашивания беременности и выявляют взаимосвязь с терратогенным эффектом химических средств 17 .
Другие хронические заболевания
В результате воздействия токсических лекарственных средств увеличивается количество случаев развития хронических заболеваний печени, таких как гепатит и фиброз 18 .

Рис. 1. Причины химического загрязнения и их возможные последствия.

Финансовые затраты

При возникновении химического загрязнения кожи или слизистых персонала нормативные документы стационаров требуют тщательно промыть загрязненную поверхность в течение 10 минут. В случае попадания химического средства в глаза необходим осмотр офтальмолога 20 . В дополнение к потерям, связанным с временной нетрудоспособностью, прибавляются еще и расходы на средства для промывания, лекарственные средства и лечение острых симптомов химического отравления.

В настоящее время стоимость лечения дерматита и аллергических реакций, вызванных длительным повреждающим воздействием химических средств, достоверно не определена, но есть следующие данные: часть сотрудников использует больничный (21 %) или меняет место работы (21 %) 21 . Необходимо также учитывать расходы, связанные со снижением эффективности работы персонала и обучением вновь набранного персонала.

Другой случай снижения производительности труда связан с развитием онкологических заболеваний. Например, в Великобритании законодательством установлен отпуск для пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями, длительностью 28 недель с пособием в размере 90 € в день 22 .

В некоторых странах в случае, если будут доказаны последствия для здоровья персонала, связанные с нарушением техники безопасности на рабочем месте, возможны серьезные, в том числе и экономические, последствия для стационара. 23

Расчет затрат

На таблице № 2 показан анализ возможных дополнительных затрат на лечение осложнений, связанных с химическим загрязнением.

Табл. 2. Анализ возможных затрат на лечение осложнений, связанных с химическим загрязнением 22–26 .

Профилактические мероприятия

Рис. 3. Централизованное приготовление лекарственных препаратов

Действующие организации по профилактике химического загрязнения:

The National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH), США;
Centers for Disease Control and Prevention (CDC), США;
International Society of Pharmacovigilance (ISOP);
German Society for Oncology Pharmacy (DGOP), Германия;
Swedish Work Environment Authority (AFS), Швеция.

Чаще всего профилактические мероприятия для снижения химической контаминации рекомендуют государственные и международные организации.

Основные способы профилактики

Централизованное приготовление фармацевтических препаратов обеспечивает защиту персонала от контакта с химиопрепаратами 13 . В этом случае приготовление лекарственных средств осуществляется специально подготовленным персоналом.
Использование специального инфузионного оборудования и принадлежностей позволяет предотвратить химическое загрязнение 1 . Данные устройства предотвращают выделение аэрозоля (аэрозольные фильтры), например, попадание капель раствора на поверхности (безыгольные устройства).

Рис. 5: Использование лабораторных вытяжных шкафов

Необходимо использовать специальные помещения, так как источником химического загрязнения может стать поверхность флаконов (рис. 5).

Применение лабораторных вытяжных шкафов или специально оборудованных помещений для приготовления и смешивания химиопрепаратов позволяет избежать химического загрязнения 19 .
Контакта с химиопрепаратами можно избежать, используя специальную медицинскую одежду: халаты, маски, перчатки 13 .
Регулярные обследования, в том числе анализ крови, рекомендуется проводить для контроля степени вредного воздействия химиопрепаратов на медицинский персонал. Только в случае строгого соблюдения правил безопасности при проведении химиотерапии можно снизить вредное воздействие на здоровье персонала 13 .

Устройства для обеспечения безопасности

Мини-Спайк Хемо

Дискофикс С с Сэйффлоу

Кран для инфузионной терапии и мониторинга

Экофлак Коннект

Двухсторонняя канюля для смешивания растворов

Удлинительная линия с коннектором Сэйффлоу

Удлинительная линия для безыгольного подсоединения шприцев и инфузионных линий

Интрафикс СэйфСет

Безопасная инфузионная система

Комби-стоппер заглушка

Заглушка с винтовым соединением Люэр Лок c наружной и внутренней резьбой

Каталог продукции

Информация о всей продукции Б. Браун.

Узнать больше о безопасности с Б. Браун

Напишите нам и мы ответим на ваши вопросы.

Список литературы

1 NIOSH. (2004) Preventing Occupational Exposures to Antineoplastic and other Hazardous Drugs in Healthcare Settings.

_{2 Kromhout H, Hoek F, Uitterhoeve R, Huijibers R, Overmars RF, Anzion R, Vermeulen R. (2000) Postulating a dermal pathway for exposure to anti-neoplastic drugs among hospital workers. Applying a conceptual model to the results of three workplace surveys. Ann Occup Hyg; 44(7):551-60}

_{3 Schierl R, Böhlandt A, Nowak D. (2009) Guidance Values Surface Monitoring of Antineoplastic Drugs in German Pharmacies. Occup Hyg; 53(7): 703-711}

_{4 Mason HJ, Morton J, Garfitt SJ, Igbal S, Jones K. (2003) Cytotoxic drug contamination on the outside of vials delivered to a hospital pharmacy. Ann Occup Hyg; 47(8):681-5}

_{5 Schmaus G, Schierl R, Funck S. (2002) Monitoring surface contamination by antineoplastic drugs using gas chromatography-mass spectometry and voltammetry. Am J Health Syst Pharm; 59(10):956-61}

_{8 Connor TH, DeBord DG, Pretty JR, Oliver MS, Roth TS, Lees PS, Krieg EF Jr, Rogers B, Escalante CP, Toennis CA, Clark JC, Johnson BC, McDiarmid MA. (2010) Evaluation of antineoplastic drug exposure of health care workers at three university-based US cancer centers. J Occup Environ Med. 2010 Oct; 52(10):1019-27}

_{9 Sessink PJ. Wittenhorst BC, Anzion RB, Bos RP. (1997) Exposure of pharmacy technicians to antineoplastic agents: reevaluation after additional protective measures. Arch Environ Health ; 52(3): 240-4}

_{10 Gielen K, Goossens A. (2001) Occupational allergic contact dermatitis from drugs in healthcare workers. Contact Dermatitis; 45(5): 273-9}

_{12 Placlitaxel SmPC (2010)}

_{14 Health Counsel (1994)}

_{15 Sessink PJ, Kroese ED, van Kranen HJ, Bos RP. (1995) Cancer risk assessment for health care workers occupationally exposed to cyclophosphamide. Int Arch Occup Environ Health; 67(5):317-23}

_{16 Skov T, Maarup B, Olsen J, Rørth M, Winthereik H, Lynge E. (1992) Leukaemia and reproductive outcome among nurses handling antineoplastic drugs. Br J Ind Med; 49(12): 855-61}

_{17 Connor TH, Lawson CC, Polovich M, McDiardmid MA. (2014) Reproductive health risks associated with occupational exposures to antineoplastic drugs in health care settings: a review of evidence. J Occup Environ Med; 56(9):901-10}

_{18 Sotaniemi EA, Sutinen S, Arranto AJ, Sutinen S, Sotaniemi KA, Lehtola J, Pelkonen RO. (1983) Liver damage in nurses handling cytostatic agents. Acta Med Scand; 214(3):181-9}

_{19 Solass W, Giger-Pabst U, Zieren J, Reymond MA. (2013) Pressurized intraperitoneal aerosol chemotherapy (PIPAC): occupational health and safety aspects. Ann Surg Oncol; 20(11):3504-11}

_{26 Based on Uk National Health Service (NHS) pay recommendations: approximate annual salary of 30,000 € (100 € per day) - [NHS 2010]}

_{27 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans - Overall Evaluations of Carcinogenicity: An Updating of IARC Monographs 1987. Supplemen 7; Volumes 1-42}

_{28 US Bureau of Labor Statistics. May 2006 National and Occupational Employment and Wage Estimates. Washington DC: United States Department of Labor, Bureau of Labor Statistics; 2007.}

_{29 Lawson CC, Rocheleau CM, Whelan EA, et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. Am J Obstet Gynecol 2012;206:327.e1-8.}

Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные образцы положительного и отрицательного контроля.

Положительный контроль – включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя. Положительный контрольный образец, используемый в каждой постановке ПЦР, должен соответствовать следующим требованиям:

быть стабильным в течение срока хранения тест-системы;

иметь точно измеренную концентрацию ДНК или РНК в препарате;

иметь аттестацию в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (наличие стандартных образцов производителя или отраслевых стандартных образцов).

Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации, а также позволяет исключить учет ложноположительных результатов.

Внутренний контроль вко

ВКО – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, имеющий те же сайты узнавания праймерами, что и ДНК или РНК микроорганизма, но размер амплифицированного ВКО превышает размер специфического ампликона. ВКО не должен конкурентно ингибировать в ПЦР при минимальных количествах ДНК микроорганизма.

Использование ВКО на этапе обработки клинического материала позволяет проверить качество проведения важных элементов ПЦР анализа:

Контроль потерь ДНК/РНК и эффективность экстракции при обработке биологического материала.

Контроль эффективности удаления ингибиторов ПЦР.

Контроль работы лабораторного персонала.

Строгое соблюдение правил работы в ПЦР лаборатории позволяет обеспечить достаточную надежность лабораторных данных, что имеет огромное значение для оказания высококачественной медицинской помощи.

Проблема контаминации

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. При проведении ПЦР-анализа возможны две причины возникновения контаминации:

перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;

контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР – анализа ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся воздухом с пылью, с аэрозолями, а также через приборы или руки. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложнопожительных результатов.

Для любой лабораторной методики основной проблемой является профилактика ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Существуют два вида ошибок на аналитическом этапе при проведении ПЦР-анализа: ложноположительные и ложноотрицательные.

Ложноположительные результаты на лабораторном этапе могут возникать при контаминации (загрязнении) как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Это наиболее трудно выявляемый вид ошибок.

Основной причиной ложноположительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. В ходе постановки реакции амплификации происходит избирательное размножение участка ДНК (ампликона) искомого возбудителя. Количество ампликона в пробе при завершении реакции может достигать миллиардов копий. При неосторожном обращении с пробами после реакции амплификации, даже просто при открывании пробирки трудно избежать аэрозольного выброса макроколичеств реакционной смеси в атмосферу рабочего помещения. При этом может происходить контаминация воздуха, рабочей поверхности, перчаток, пипеток и т.д. Учитывая тот факт, что чувствительность реакции составляет единичные молекулы ДНК, а при аэрозольном выбросе возможно попадание в атмосферу сотен тысяч молекул, то очень высока вероятность попадания ампликона в исследуемые пробы. В этом случае получается положительный результат не вследствие наличия в пробе искомого инфекционного агента, а в результате размножения ампликона.

Ложноотрицательные результаты на лабораторном этапе возникают в случаях: потери ДНК во время неправильной транспортировки, при несоблюдении технологии выделения ДНК, при использовании некачественных реактивов. Добавление ВКО в пробу до выделения ДНК позволяет решить эту проблему. Ускоренные методы выделение ДНК также увеличивает вероятность потери ДНК/РНК, особенно заметные при работе с небольшими количествами ДНК в образце.

Одной из основных причин такого рода результатов является наличие в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Чаще всего с такими результатами приходится сталкиваться при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, т.к. эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени. Проверить наличие ингибиторов в исследуемой пробе можно путем добавления аликвоты пробы в образец с контрольной ДНК-мишенью, имеющейся в каждом наборе (ВКО). Если в результате проведенного эксперимента не получается ожидаемый фрагмент ДНК, значит исследуемый образец содержит ингибирующие компоненты. В этом случае необходимо еще раз тщательно отмыть образец, убедиться в высоком качестве реагентов, используемых для выделения ДНК и повторить реакцию амплификации.

Другая причина ложноотрицательных результатов - это низкая активность фермента Taq-полимеразы и деградация дезоксинуклеотидтрифосфатов или олигонуклеотидных праймеров, обусловленная неправильным хранением или частым замораживанием и оттаиванием реагентов.

Существует несколько способов борьбы с контаминацией:

одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы.

другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации;

третьим – проблема ложноположительных результатов решается с помощью организационных мероприятий (см. выше).

Отбор клинического материала осуществляет медицинский персонал с соблюдением правил противоэпидемического режима, только стерильными одноразовыми инструментариями (шприцы, соответствующие зонды, цитощеточки и пр.), в одноразовых перчатках.

Максимально полно собрать материал из выбранного локуса, используя подходящие для этого аппликаторы – зонды, цитощетки (обеспечить адекватность клинического образца).

Сохранить полученный материал (ДНК/РНК микроорганизмов), используя надежные транспортные среды и консерванты, предоставляемые ПЦР-лабораторией. Среда для транспортировки и хранения клинического материала обеспечивает стабильность РНК и ДНК при комнатной температуре до 28 дней.

Поместить взятый материал в вакуэты с ЭДТА (кровь), в одноразовые химически чистые пробирки «Эппендорф» (мазки, ликвор, биоптат и др.). Основным условием при сборе материала является предотвращение попадания в пробу ДНК-аз и рибонуклеаз, т.к. рибонуклеазы и ДНК-азы – ферменты деградации РНК и ДНК. Они чрезвычайно стабильны в окружающей среде, выдерживают длительное кипячение. Основной источник нуклеаз – кожные покровы, частицы пыли. Пластиковые пробирки и наконечники должны иметь маркировку «DNase, RNase- free» (свободные от нуклеаз).

Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.

При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгивания и расплескивания, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.

Для исключения взаимной контаминации образцы хранить и транспортировать в отдельном полиэтиленовом пакете или штативах. При необходимости переноса образца использовать автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками с аэрозольными барьерами.

До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранить при температуре 2–4 °С не более 48 часов. Необходимо минимизировать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа. Транспортировка образцов осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.

Кровь, плазма, сыворотка

Забор крови рекомендуется проводить с использованием вакуумных систем. Внедрение таких систем позволяет стандартизировать манипуляции с кровью, положительно сказывается на всех этапах лабораторного исследования и в целом переводит работу лаборатории на иной, более высокий уровень качества. Их использование гарантирует защиту персонала от инфицирования, сокращается время, затрачиваемое на процедуру забора крови, значительно реже сопровождается гемолизом, позволяет сохранить стерильность проб крови и герметично транспортировать.

Венепункцию рекомендуется выполнять натощак из локтевой вены в специальную вакуумную пробирку с антикоагулянтом, после чего пробирка переворачивается для перемешивания несколько раз. Пробирки с кровью хранят в холодильнике при +4 °С – +8 °С. Максимальный срок хранения крови – 1 сутки (не замораживать!). В случае необходимости длительного хранения необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -16 о -20 о С не более 2 недель.

Характеристика вакуумных систем, используемых для ПЦР-диагностики:

Вакуэты с ЭДТА (6 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. ЭДТА-антикоагулянт хорошо фиксирует нуклеиновые кислоты клетки.

Вакуэты с цитратом натрия (3,8 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. Не подходят для длительной транспортировки, т.к. цитрат является хорошей питательной средой для посторонней микрофлоры.

Вакуэты без антикоагулянтов (сыворотка крови) – используются для проведения качественных исследований. Использования сыворотки крови для количественных исследований нежелательно, т.к. часть инфекционного агента оседает в сгустке крови, при этом снижается возможность определения количественного содержания его в крови.

Вакуэты с гепарином - категорически не подходят для ПЦР - реакции. Гепарин является полианионом, как и ДНК, поэтому в ПЦР-реакции конкурирует с ДНК.

Читайте также: